硬組織的病理觀測(cè)對(duì)于研究骨骼、牙齒等器官疾病的發(fā)展具有很重要的意義。但是硬組織由于其本身硬度大難以被傳統(tǒng)的薄片切割機(jī)直接切割，因此在切割之前往往需要脫鈣處理，使其軟化以達(dá)到刀片所能夠承受的硬度范圍內(nèi)進(jìn)行切割。但是鈣質(zhì)作為骨骼和牙齒的組成部分，進(jìn)行脫鈣將不可避免的丟失所研究器官中的信息，尤其是在含鈣量高的牙釉質(zhì)等部位中。同時(shí)，鈣在早期硬組織愈合如牙質(zhì)修復(fù)、骨創(chuàng)傷愈合等過程中也起著重要作用。另外脫鈣還不可避免的改變了硬組織的形貌，諸如厚度變化、褶皺、軟硬組織分離等問題。因此尋找無需脫鈣的切割方法對(duì)于研究硬組織研究是十分必要的。

    隨著激光技術(shù)的發(fā)展，這難題有望得到解決。對(duì)于刀片切割來說，受到刀片材料本身的限制，無法切割比刀片更硬的物體，但是這個(gè)困難在激光切割中并不存在 。然而激光切割也有其缺點(diǎn)：作為種高能光束，其本身蘊(yùn)含的能量較高容易灼傷物體表面，從而影響切割效果；另外受到激光在穿透物體時(shí)將不可避免的被所穿透物體中的組分散射，從而限制了激光切割的深度。近幾年發(fā)展較為迅速的雙光子聚焦技術(shù)給激光3D切割帶來了新的可能。

    雙光子切割具有如下勢(shì)：雙光子能夠穿透定深度的樣品，因此能夠直接在物體內(nèi)部進(jìn)行切割，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)組織深層區(qū)域的切割；其次雙光子的聚焦點(diǎn)能夠控制，可實(shí)現(xiàn)以往切割設(shè)備不能實(shí)現(xiàn)的3D切割；另外雙光子般采用近紅外激光作為激發(fā)光源，這類激光往往擁有杰出穿深并且對(duì)于蛋白的吸收較低，基本不會(huì)灼傷樣品。后雙光子切割相比于傳統(tǒng)打磨方法來說更為，樣品的損失更少。

    在制樣上來說，雙光子切割也十分的簡單。根據(jù)目前文獻(xiàn)上主要采用的方法可以總結(jié)為：使用甲醛固定，然后使用PMMA包埋，接下來使用雙光子激光切割設(shè)備切割，經(jīng)過簡單打磨后，就可以染色壓片了。這比起傳統(tǒng)的硬組織切割步驟更為簡單，制備時(shí)間更短。并且制備效果比傳統(tǒng)方法更。 

雙光子切割實(shí)際效果圖精選

觀察骨組織的修復(fù)過程

激光切割人體第四腰椎垂直切片前部。C. SEM; D. PLM; E. SEM + PLM。從圖中可以清晰看到骨組織表面修復(fù)。 

觀察基因缺陷對(duì)骨組織的影響 

小鼠脛骨的SEM圖像。A.Phospho1敲除（KO）的脛骨近端顯示非礦化基質(zhì)類骨；B. 脛骨骨干。白色箭頭顯示骨髓內(nèi)表面的骨樣斑塊。黑色箭頭顯示位于皮質(zhì)血管的骨樣區(qū)（向下至20-50 lm區(qū)域）的大小變化；C. 膝蓋。致密纖維結(jié)締組織骨膜位于白色箭頭處；D.WT的對(duì)照關(guān)節(jié)。 

觀察手術(shù)后的骨組織再生 

節(jié)段性缺損愈合的組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。a-d。Safranin Orange/von Kossa染色觀測(cè)修復(fù)手術(shù)愈合效果的脛骨代表性圖片，LA，外側(cè)；ME，內(nèi)側(cè)；PR，近端；DI，遠(yuǎn)端，對(duì)側(cè)鋼板。e.手術(shù)后周內(nèi)采集的對(duì)照樣本作標(biāo)本圖片。自體松質(zhì)骨移植（ABG）對(duì)蜂巢的增強(qiáng)作用黑色（藍(lán)色星）和支架中心孔內(nèi)明顯的截骨術(shù)血腫（白色星）仍然可見。 

牙齒病理觀測(cè)

大鼠牙本質(zhì)切片觀測(cè)	人牙齒切片觀測(cè)

參考文獻(xiàn)

[1] Will, Fabian, and Heiko Richter. "Laser‐based Preparation of Biological Tissue: Femtosecond lasers speed up histological procedures in Medtech." Laser Technik Journal 12.5 (2015): 44-47

[2] Kunert-Keil, Christiane, et al. "Histological comparison between laser microtome sections and ground specimens of implant-containing tissues." Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger 222 (2019): 153-157.

[3] Joner, Michael, et al. "Very late scaffold thrombosis: insights from optical coherence tomography and histopathology." EuroIntervention 13 (2018): e2169-e2173.

[4] Will, Fabian G., et al. "Laser microtome: all optical preparation of thin tissue samples." Commercial and Biomedical Applications of Ultrafast Lasers VII. Vol. 6460. International Society for Optics and Photonics, 2007.

[5] Ngezahayo, A., et al. "Intracellular manipulation of single cells using ultrashort laser pulses: mitochondria and cytoskeleton." EUROPEAN JOURNAL OF CELL BIOLOGY. Vol. 88. 

[6] Schwerk, Birthe, et al. "Comparison of two prototypes of a magnetically adjustable glaucoma implant in rabbits." PloS one 14.4 (2019): e0215316.