技術(shù)文章
TECHNICAL ARTICLES單細胞測序在疾病診斷和細胞異質(zhì)性研究中發(fā)揮著重要作用。然而目前的單細胞測序手段需要將細胞消化并裂解才能夠進行,而細胞狀態(tài)在這操作中不可避免的會發(fā)生改變,因此很難掌握細胞真實的基因表達情況,尤其對于基因通路上表達變化的檢測為不。近期蘇伊士理工大學(xué)使用FluidFM創(chuàng)建了種原位活細胞基因測序方法,這種方法能夠在不殺死細胞的情況下完成對細胞的測序工作。通過這種技術(shù)該團隊成功完成單細胞RNA基因測序,并通過這種方法檢測到了細胞的基因表達和細胞周期狀態(tài)變化。下面本文就這項工作的具體內(nèi)容進行闡述。
1. Live-Seq測序技術(shù)簡述
由于單個細胞的RNA總量僅有10 pg。為了實現(xiàn)無損的單細胞測序,該團隊使用FluidFM對現(xiàn)有的scRNA-Seq單細胞測序的方法進行了化。為了盡可能的接近Smart-Seq的測試條件,該團隊采用了將緩沖液吸入探針,然后再進行細胞提取的操作。這樣可以確保所提取的RNA能夠很快與緩沖液混合,從而避免RNA的降解。通過這方法,該團隊成功實現(xiàn)了IBA細胞的測序,證明了這種方法的可行性(圖1)。
圖1. Live-Seq技術(shù)
a. Live-Seq技術(shù)的示意圖和代表圖片,黑色箭頭指代液面;b. IBA細胞測序的質(zhì)量控制圖(n=10)。
2. Live-Seq技術(shù)分析細胞系和細胞狀態(tài)
為了證實Live-Seq的有效性,該團隊對多種細胞系進行了測序,這其中包括IBA細胞、小鼠脂肪干細胞和祖細胞(ASPCs)以及脂多糖處理的RAW264.7細胞和Mock處理的RAW264.7細胞。通過對這些細胞系進行測序發(fā)現(xiàn),該方法能夠區(qū)分上述細胞系,并且在征基因檢測中能夠找到每種細胞所對應(yīng)的征基因,證明了Live-Seq方法的有效性(圖2)。
圖2. Live-Seq單細胞測序區(qū)分細胞型及細胞狀態(tài)
a. 實驗方法示意圖,使用LPS和PBS對RAW細胞進行處理;b. 前500個高度易變基因的tSNE圖;c.1~10的細胞型、細胞狀態(tài)差別基因的熱圖;d. 小鼠基因圖譜預(yù)測,使用1~100個標(biāo)記基因的團簇;e. Live-Seq對比scRNA-Seq的錨點分析,顯示兩者沒有顯著差異。
3. Live-Seq技術(shù)對細胞的活力基本沒有影響
Live-Seq技術(shù)的顯著勢在于提取過程中不會破壞細胞。通過對提取前后的測序?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn),提取組與空白組之間的團簇沒有顯著性差異。并且通過對細胞形態(tài)的觀察,發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)基本沒有改變,并且多數(shù)細胞仍然能夠正常分裂(圖3)。
圖3. Live-Seq對細胞活力的影響
a. 細胞實驗的示意圖;b. Live-Seq測序后不同時間點(1h,4h)的scRNA-Seq的tSNE圖;c.不同時間點scRNA-Seq所有能夠發(fā)現(xiàn)差異的基因(共12個);d.不同時間點的細胞形態(tài)圖片。
4. Live-Seq技術(shù)能夠記錄細胞下游分子表型事件
由于Live-Seq對細胞生理狀態(tài)影響小,因此能夠監(jiān)測在細胞代謝過程中的基因變化。通過對比LPS處理的巨噬細胞周期實驗發(fā)現(xiàn),Live-seq技術(shù)與對照組的細胞代謝水平相比沒有明顯變化,因此這種方法測量的數(shù)據(jù)十分接近細胞代謝中基因表達的真實水平。通過測序?qū)Ρ萀PS處理與空白的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nfkbia與Tnf的表達為相關(guān)。這結(jié)果也驗證這種測序方法在檢測細胞下游表型時的勢。
圖4. Live-Seq技術(shù)的單細胞縱向分析
a. 實驗示意圖;b. 不同處理細胞的mCherry強度變化;c. 3~7.5h之間mCherry強度變化;d. Tnf-mCherry強度變化的線性回歸模型;e. Nfkbia與Tnf在Live-Seq測序中的表達關(guān)系;f. Nfkbia與Tnf在scRNA-Seq測序中的表達關(guān)系;g. Live-Seq測序中細胞處于S期的評分;h. Live-Seq測序中細胞周期的mTnf-mCherry強度變化;i.Tnf-mCherry的熒光強度增量(3~7.5h)。
5. Live-Seq技術(shù)對同細胞多次測序
Live-Seq技術(shù)的無損性甚至能夠?qū)崿F(xiàn)對單個細胞的多次測序。通過對單個細胞兩次提取后細胞活力變化的觀察中發(fā)現(xiàn),細胞的活力即使在2次提取后仍沒有發(fā)生明顯的變化,基因型分析也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的基因表型改變。
圖5. Live-Seq對細胞的多次提取
j.連續(xù)測序的示意圖和代表圖像;k.Live-Seq的tSNE圖;l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE圖。
6. 總結(jié)
Live-Seq是種十分具有前景的單細胞測序的新方法,得益于FluidFM技術(shù)的無損提取的勢,Live-Seq技術(shù)除了能夠?qū)崿F(xiàn)傳統(tǒng)測序的功能外,還降低了細胞的損傷,能夠提供更加原生和真實的測序信息。這種點甚至讓單細胞的基因表達動力學(xué)研究成為可能。相信隨著這種技術(shù)自動化的提高,將為單細胞測序技術(shù)帶來更多可能。
參考文獻:
[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. Gäbelein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752;
DOI: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752
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