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多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)合為體的單細(xì)胞操作系統(tǒng)，采用不同孔徑的微型納米注射器，可實現(xiàn)單細(xì)胞注射（Injection）、活細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)提取（Extraction）、單細(xì)胞分離（Isolation）、粘附力測定（Adhesion）、納米打印(Nano-printing)等多種功能，更多功能及應(yīng)用請參考如下文章。

點擊了解更多詳情：多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT的原理與應(yīng)用介紹

本次講座與培訓(xùn)將介紹FluidFM技術(shù)的原理及應(yīng)用，著重講解在活細(xì)胞單細(xì)胞組學(xué)域的進(jìn)展，Live-Seq技術(shù)可直接在活細(xì)胞無損提取細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行測序工作，能夠提供更加原生和真實的測序信息，讓單細(xì)胞的基因表達(dá)動力學(xué)研究成為可能。

報告信息：

應(yīng)用講座：

5月25日

北京大學(xué)金光樓311上午09:30—10:30

上機(jī)培訓(xùn)（掃碼報名，名額有限）：

5月25日

北京大學(xué)金光樓126下午13:00—17:30

報告人:  胡西 博士

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報告人簡介：

胡西，Application Scientist of Quantum Design China，加州大學(xué)洛杉磯分校博士后。主要負(fù)責(zé)單細(xì)胞顯微操作設(shè)備的技術(shù)支持和市場推廣活動，并具有豐富的流體力顯微鏡（FluidFM）的操作經(jīng)驗。

主辦單位：鳳凰工程北大基地光學(xué)成像平臺

協(xié)辦單位：Quantum Design 中國

科研進(jìn)展文章導(dǎo)讀：

單細(xì)胞測序在疾病診斷和細(xì)胞異質(zhì)性研究中發(fā)揮著重要作用。然而目前的單細(xì)胞測序手段需要將細(xì)胞消化并裂解才能夠進(jìn)行，而細(xì)胞狀態(tài)在這操作中不可避免的會發(fā)生改變，因此很難掌握細(xì)胞真實的基因表達(dá)情況， 尤其對于基因通路上表達(dá)變化的檢測為不。近期蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院使用FluidFM創(chuàng)建了種原位活細(xì)胞基因測序方法，這種方法能夠在不殺死細(xì)胞的情況下完成對細(xì)胞的測序工作。通過這種技術(shù)該團(tuán)隊成功完成單細(xì)胞RNA基因測序，并通過這種方法檢測到了細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞周期狀態(tài)變化。下面本文就這項工作的具體內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1. Live-Seq測序技術(shù)簡述

由于單個細(xì)胞的RNA總量僅有10 pg。為了實現(xiàn)無損的單細(xì)胞測序，該團(tuán)隊使用FluidFM對現(xiàn)有的scRNA-Seq單細(xì)胞測序的方法進(jìn)行了化。為了盡可能的接近Smart-Seq的測試條件，該團(tuán)隊采用了將緩沖液吸入探針，然后再進(jìn)行細(xì)胞提取的操作。這樣可以確保所提取的RNA能夠與緩沖液混合，從而避免RNA的降解。通過這方法，該團(tuán)隊成功實現(xiàn)了IBA細(xì)胞的測序，證明了這種方法的可行性（圖1）。

圖1. Live-Seq技術(shù)a. Live-Seq技術(shù)的示意圖和代表圖片，黑色箭頭指代液面；b. IBA細(xì)胞測序的質(zhì)量控制圖（n=10）。

2. Live-Seq技術(shù)分析細(xì)胞系和細(xì)胞狀態(tài)

為了證實Live-Seq的有效性，該團(tuán)隊對多種細(xì)胞系進(jìn)行了測序，這其中包括IBA細(xì)胞、小鼠脂肪干細(xì)胞和祖細(xì)胞（ASPCs）以及脂多糖處理的RAW264.7細(xì)胞和Mock處理的RAW264.7細(xì)胞。通過對這些細(xì)胞系進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，該方法能夠區(qū)分上述細(xì)胞系，并且在征基因檢測中能夠找到每種細(xì)胞所對應(yīng)的征基因，證明了Live-Seq方法的有效性（圖2）。

圖2. Live-Seq單細(xì)胞測序區(qū)分細(xì)胞型及細(xì)胞狀態(tài)a. 實驗方法示意圖，使用LPS和PBS對RAW細(xì)胞進(jìn)行處理；b. 前500個高度易變基因的tSNE圖；c. 前面10個的細(xì)胞型、細(xì)胞狀態(tài)差別基因的熱圖；d. 小鼠基因圖譜預(yù)測，使用前面100個標(biāo)記基因的團(tuán)簇；e. Live-Seq對比scRNA-Seq的錨點分析，顯示兩者沒有顯著差異。

3. Live-Seq技術(shù)對細(xì)胞的活力基本沒有影響

Live-Seq技術(shù)的勢在于提取過程中不會破壞細(xì)胞。通過對提取前后的測序?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn)，提取組與空白組之間的團(tuán)簇沒有顯著性差異。并且通過對細(xì)胞形態(tài)的觀察中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)基本沒有改變，并且多數(shù)細(xì)胞仍然能夠正常分裂（圖3）。

圖3. Live-Seq對細(xì)胞活力的影響a. 細(xì)胞實驗的示意圖；b. Live-Seq測序后不同時間點（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE圖；c.不同時間點scRNA-Seq所有能夠發(fā)現(xiàn)差異的基因（共12個）；d.不同時間點的細(xì)胞形態(tài)圖片。

4. Live-Seq技術(shù)能夠記錄細(xì)胞下游分子表型事件

由于Live-Seq對細(xì)胞生理狀態(tài)影響小，因此能夠監(jiān)測在細(xì)胞代謝過程中的基因變化。通過對比LPS處理的巨噬細(xì)胞周期實驗中發(fā)現(xiàn)，Live-seq技術(shù)與對照組的細(xì)胞代謝水平相比沒有明顯變化，因此這種方法測量的數(shù)據(jù)十分接近細(xì)胞代謝中基因表達(dá)的真實水平。通過測序?qū)Ρ萀PS處理與空白的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nfkbia與Tnf的表達(dá)為相關(guān)。這結(jié)果也驗證這種測序方法在檢測細(xì)胞下游表型時的勢。

圖4. Live-Seq技術(shù)的單細(xì)胞縱向分析a. 實驗示意圖；b. 不同處理細(xì)胞的mCherry強(qiáng)度變化；c. 3~7.5h之間mCherry強(qiáng)度變化；d. Tnf-mCherry強(qiáng)度變化的線性回歸模型；e. Nfkbia與Tnf在Live-Seq測序中的表達(dá)關(guān)系；f. Nfkbia與Tnf在scRNA-Seq測序中的表達(dá)關(guān)系；g. Live-Seq測序中細(xì)胞處于S期的評分；h. Live-Seq測序中細(xì)胞周期的mTnf-mCherry強(qiáng)度變化；i.Tnf-mCherry的熒光強(qiáng)度增量（3~7.5h）。

5. Live-Seq技術(shù)對同細(xì)胞多次測序

Live-Seq技術(shù)的無損性甚至能夠?qū)崿F(xiàn)對單個細(xì)胞的多次測序。通過對單個細(xì)胞兩次提取后細(xì)胞活力變化的觀察中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的活力即使在2次提取后仍沒有發(fā)生明顯的變化，基因型分析也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的基因表型改變。

圖5. Live-Seq對細(xì)胞的多次提取j.連續(xù)測序的示意圖和代表圖像；k.Live-Seq的tSNE圖；l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE圖。

6. 總結(jié)

Live-Seq是種十分具有前景的單細(xì)胞測序的新方法，得益于FluidFM技術(shù)的無損提取的勢，Live-Seq技術(shù)除了能夠?qū)崿F(xiàn)傳統(tǒng)測序的功能外，還降低了細(xì)胞的損傷，能夠提供更加原生和真實的測序信息。這種點甚至讓單細(xì)胞的基因表達(dá)動力學(xué)研究成為可能。相信隨著這種技術(shù)自動化的提高，將為單細(xì)胞測序技術(shù)帶來更多可能。

參考文獻(xiàn)：

[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. Gäbelein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752；doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752

相關(guān)產(chǎn)品

1、多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)- FluidFM BOT